傳統的菌種保存方式簡介

•   斜面保(bao)(bao)存(cun)法(fa)：微生物保(bao)(bao)存(cun)基本的方法(fa)，可(ke)廣泛用(yong)于細菌、真菌等，保(bao)(bao)存(cun)期限非常短，斜面容易干(gan)裂(lie)。

•   液體石蠟保存(cun)法：可用于(yu)保存(cun)霉菌(jun)、酵母菌(jun)、放線菌(jun)及(ji)需氧菌(jun)，方法簡便，可防止斜面干燥和(he)氧氣(qi)進(jin)入，但一些(xie)固氮菌(jun)、分枝桿菌(jun)、毛霉、厭氧菌(jun)等不(bu)適宜用此(ci)法。

•   甘油(you)冷凍保存法：用于一般細菌的保存，需使甘油(you)終(zhong)濃度為(wei)20%左右，然(ran)后-20℃或(huo)-70℃以下保存。融化(hua)時需要(yao)水浴(yu)溶化(hua)。

•   真空冷(leng)凍(dong)保存(cun)法(fa)：具(ju)有低溫、干燥、無(wu)氧的(de)保存(cun)條(tiao)件(jian)，適用(yong)于98%以上菌(jun)種的(de)保存(cun)，但(dan)操作(zuo)復雜，一般實(shi)驗室難以使用(yong)。

•   液氮保(bao)存法：基(ji)本(ben)所有微(wei)生物均可(ke)保(bao)存，并且(qie)保(bao)存時(shi)間長，但操(cao)作較為復雜(za)而且(qie)需要(yao)設(she)備，不適用于一般(ban)實驗室保(bao)存菌(jun)種。

•   沙土保存(cun)法

•   半固體保存法(fa)

瓷珠菌種保存法的原理

瓷(ci)(ci)珠菌種(zhong)保存(cun)管是實(shi)驗(yan)室保存(cun)菌種(zhong)的容(rong)器，管內(nei)有表面凹孔小瓷(ci)(ci)珠用于(yu)細菌的吸附和保存(cun)，放置于(yu)-20℃或-80℃下便可(ke)創造(zao)干(gan)燥、低溫、缺營養的環境，使菌株處于(yu)“休眠” 狀態(tai)，方(fang)可(ke)長(chang)期保存(cun)（視不(bu)同(tong)菌種(zhong)與(yu)保存(cun)溫度，一般可(ke)保存(cun)3-10 年）, 同(tong)時菌種(zhong)保存(cun)管的取(qu)(qu)用和保存(cun)較(jiao)為便利（取(qu)(qu)用復蘇(su)及保存(cun)菌種(zhong)僅需(xu)1分鐘）。

瓷珠菌種保存管的優點

•      用途：菌種(zhong)保存、復蘇和運(yun)輸。

•      優點：操作簡單方便(bian)、菌種(zhong)保(bao)存(cun)快速、包裝物體積小、菌種(zhong)保(bao)存(cun)時間(jian)長。

•     操(cao)作簡單方便：挑取細菌新鮮純培養(yang)物，接入菌種保存管。

•     菌(jun)種保(bao)存(cun)快速：混勻后，吸出(chu)冷凍保(bao)存(cun)液。

•     包裝物體積(ji)小：1.8ml冷凍管。

•     菌(jun)種(zhong)保存時間長：2-8℃可(ke)保存6個月(yue)；-20℃可(ke)保存12個月(yue)；-80℃可(ke)保存24個月(yue)。

瓷珠菌種保存管的使用方法

菌種保存流程

1.從培養18h以上的(de)平板上刮去新(xin)鮮純培養物(wu)于菌種保(bao)存管中，配成大(da)約3-4麥氏比濁(zhuo)度的(de)菌懸液。

2.擰緊保存管，來回顛(dian)倒(dao)幾次使(shi)細菌乳化(hua)，不能旋(xuan)搖。

3.用無(wu)菌(jun)移(yi)液器將菌(jun)種保存(cun)管內(nei)的液體吸取干凈，妥善放置被(bei)吸出(chu)的液體。

4.擰緊保(bao)存管，迅(xun)速將其置于-20℃或-70℃冰箱中。

使用時的注意事項

•   被保(bao)存的菌(jun)種(zhong)要求是經過(guo)純化(hua)后(hou)(hou)培養 18-24h 內的新鮮菌(jun)種(zhong)（細菌(jun)18-24h，酵母(mu)菌(jun)需(xu)3 天(tian)，形(xing)成(cheng)孢(bao)(bao)子的微生物(wu)保(bao)存孢(bao)(bao)子，而放線菌(jun)和絲狀真菌(jun)需(xu)培養7 天(tian)后(hou)(hou)保(bao)存），不宜使用老(lao)化(hua)或未(wei)經鑒定的菌(jun)種(zhong)。

•   菌種(zhong)(zhong)保存(cun)濃(nong)度(du)必須要做3-4 麥(mai)氏(shi)比濁度(du)，如接(jie)種(zhong)(zhong)濃(nong)度(du)過低將會降低復蘇效果。

•   待保(bao)存(cun)于菌種(zhong)保(bao)存(cun)管(guan)中的菌種(zhong)*乳化均勻(yun)吸(xi)(xi)附在多孔小瓷珠后(hou)，要將多余的菌種(zhong)保(bao)存(cun)液(ye)吸(xi)(xi)取出(chu)來并棄之，否則(ze)在復蘇時的凍融過程中會損傷菌株(zhu)活性(xing)。

•   做厭(yan)(yan)氧菌保(bao)存時，應(ying)提供厭(yan)(yan)氧的環(huan)境(jing)，如(ru)厭(yan)(yan)氧箱(xiang)、厭(yan)(yan)氧袋，菌種保(bao)存管中(zhong)可通入(ru)氮氣來驅除保(bao)存菌種時所引入(ru)的氧氣。菌種復蘇時，也(ye)要創造(zao)厭(yan)(yan)氧的環(huan)境(jing)。

• ;  菌種復蘇完成后，對使用菌株(zhu)需要進行再(zai)次純(chun)化，以保證(zheng)菌株(zhu)的單一(yi)性。

常見問題答疑

1、菌種保存管能保存霉菌及酵母菌嗎？

答：可以。對于霉菌等真菌需培(pei)養7 天進行保存，而酵母菌需培(pei)養三天將孢(bao)子(zi)(zi)洗(xi)脫下來(lai)進行保存，保存管中的小瓷珠可以作為介質(zhi)來(lai)吸附孢(bao)子(zi)(zi)和菌絲，相(xiang)當于砂(sha)土保存法(fa)中砂(sha)土作為載體起到的作用。

2、所有的菌都能保存嗎？如果不是的話，什么樣的菌可以保存？什么樣的菌不可以保存？

答：可以。菌種(zhong)(zhong)保存(cun)(cun)的(de)原(yuan)理(li)是預防或減(jian)緩(huan)DNA 復制(zhi)時(shi)自發(fa)突變導致菌種(zhong)(zhong)退化，因此要(yao)創(chuang)造代謝不活潑的(de)狀態(tai)，而菌種(zhong)(zhong)保存(cun)(cun)時(shi)使菌種(zhong)(zhong)進入休眠態(tai)（孢(bao)子(zi)、芽(ya)孢(bao))，并創(chuang)造干(gan)燥、低溫、缺氧、缺營養的(de)環(huan)境，創(chuang)造的(de)環(huan)境越接近(jin)此狀態(tai)，所(suo)保存(cun)(cun)的(de)菌種(zhong)(zhong)的(de)時(shi)間就越長(chang)，所(suo)以從原(yuan)理(li)上講(jiang)，所(suo)有(you)菌種(zhong)(zhong)都可用(yong)這種(zhong)(zhong)方法保存(cun)(cun)， 但需要(yao)注意的(de)是，苛(ke)刻菌（如流感(gan)嗜(shi)血桿(gan)菌、腦膜(mo)炎萘瑟氏菌）等特(te)殊(shu)細菌保存(cun)(cun)時(shi)，需-80℃或更低溫度(du)保存(cun)(cun)，才可以做到(dao)更長(chang)期的(de)保存(cun)(cun)。

3、能用菌種保存管長久保存菌株嗎？

答：溫度越低(di)，保(bao)藏效果越好(hao)。從目前的(de)(de)試驗數(shu)據及實際保(bao)存(cun)(cun)效果來看，-20℃可(ke)保(bao)存(cun)(cun)1-5 年，-80℃或液氮中(zhong)可(ke)保(bao)存(cun)(cun)5-10 年，不(bu)同菌(jun)(jun)種及不(bu)同的(de)(de)保(bao)存(cun)(cun)溫度保(bao)存(cun)(cun)時(shi)間會有所(suo)不(bu)同（例如(ru)：大(da)腸(chang)、沙門等常規細菌(jun)(jun)-20℃我們(men)目前可(ke)以保(bao)存(cun)(cun)到6年）。但需(xu)要注意的(de)(de)是所(suo)保(bao)存(cun)(cun)的(de)(de)菌(jun)(jun)種需(xu)每(mei)年抽檢進行生化(hua)特征的(de)(de)鑒(jian)定，確定菌(jun)(jun)株(zhu)無變異。

4、菌種保藏時為什么要進行分離純化？

答：分離純化(hua)后才(cai)能(neng)獲得單(dan)一(yi)菌(jun)株(zhu)，單(dan)一(yi)菌(jun)株(zhu)進行菌(jun)種(zhong)保藏才(cai)有意義(yi)，防止菌(jun)種(zhong)交叉(cha)污(wu)染(ran)和(he)變異，這也(ye)是菌(jun)種(zhong)保存(cun)的基本(ben)原則。

5、菌種保存管對于平板來說，對挑選菌落個數有要求嗎？還是將整個平板的菌落全部刮入管中？

答：對于要(yao)保存(cun)(cun)的(de)(de)細菌(jun)(jun)一(yi)般(ban)是(shi)(shi)要(yao)進行(xing)2-3 次的(de)(de)純化，要(yao)保證一(yi)個(ge)平板(ban)上(shang)的(de)(de)菌(jun)(jun)是(shi)(shi)由單一(yi)菌(jun)(jun)落傳代而(er)來的(de)(de)，所以在(zai)細菌(jun)(jun)保存(cun)(cun)的(de)(de)過程中，為了保證制備的(de)(de)菌(jun)(jun)懸(xuan)液可(ke)(ke)以達到(dao)3-4MCF，是(shi)(shi)可(ke)(ke)以將整個(ge)平板(ban)的(de)(de)的(de)(de)細菌(jun)(jun)全部刮到(dao)管中的(de)(de)，如果平板(ban)長的(de)(de)比較滿一(yi)般(ban)半(ban)個(ge)平板(ban)就夠用，具體(ti)用量也根據菌(jun)(jun)種(zhong)的(de)(de)不(bu)同有(you)所差異，如霉(mei)菌(jun)(jun)、酵母(mu)菌(jun)(jun)在(zai)保存(cun)(cun)時，不(bu)適合(he)用濁度法(fa)。

6、對于液體培養基培養的純菌，是否也可以用咱們的菌種保存管？如果可以的話，怎么操作？

答：是(shi)可(ke)以(yi)用的，如(ru)果液體(ti)培養基能保(bao)證是(shi)純菌的話，可(ke)以(yi)直(zhi)接離心，棄掉上清，然后(hou)把(ba)保(bao)存管中(zhong)(zhong)液體(ti)吸進去充分混勻，然后(hou)再轉移到(dao)菌種(zhong)保(bao)存管中(zhong)(zhong)，整個過程要注意無菌操作。不過，一(yi)般菌種(zhong)保(bao)存管選擇平板菌落進行保(bao)存，因(yin)為液體(ti)培養基中(zhong)(zhong)有雜菌是(shi)不易觀察出(chu)來的。

7、為什么在菌種保存時，要上下顛倒？為什么不能旋搖？

答：上下顛倒，可使(shi)菌(jun)懸液充(chong)分混勻，菌(jun)株充(chong)分、均勻地吸(xi)附到小(xiao)瓷珠上，旋搖不(bu)利于菌(jun)懸液充(chong)分混勻,反而會使(shi)菌(jun)株全(quan)部沉淀于管底。

8、為什么在使用時要將管內的液體盡可能多的吸出？

答(da)：吸(xi)出液體可避免反復(fu)(fu)凍(dong)融(rong)形成的(de)(de)(de)(de)冰晶對菌(jun)株的(de)(de)(de)(de)損傷(shang)，加(jia)快復(fu)(fu)蘇的(de)(de)(de)(de)過程(cheng)，因(yin)此，要盡可能的(de)(de)(de)(de)將(jiang)與(yu)菌(jun)種混勻后的(de)(de)(de)(de)保存液吸(xi)凈。而常(chang)用的(de)(de)(de)(de)甘(gan)油法，在復(fu)(fu)蘇的(de)(de)(de)(de)過程(cheng)中(zhong)(zhong)需用水浴鍋快速溶解，在此過程(cheng)中(zhong)(zhong)，對菌(jun)株傷(shang)害較大。

9、在使用后，菌種保存管的保存環境？需要-80℃冰箱嗎？

答：本公司菌種保存管采(cai)用的是低(di)溫(wen)冷(leng)凍保存法，因此，使(shi)用后，需放置(zhi)低(di)溫(wen)環境，如-20℃、-80℃或液氮中保存，而且溫(wen)度越低(di)，保存效果(guo)越好。用戶需根據菌種的保存要求選擇具體(ti)保存溫(wen)度。

10、為什么說，如果有條件的話，菌種保存管置于-80 冰箱或液氮中？

答：因為，貯(zhu)存在-70℃以(yi)下(xia)低溫(wen)中能(neng)減少冰(bing)(bing)晶形成，可極(ji)大降低冰(bing)(bing)晶形成對(dui)細(xi)(xi)菌的傷害(hai)，同時(shi)可為被保存的菌種創造更低的代謝環境，從而延長細(xi)(xi)菌保存的時(shi)間。

11、為什么在取用菌株時，操作過程要求快速？

答：菌種(zhong)(zhong)(zhong)保存(cun)(cun)(cun)復(fu)蘇(su)(su)(su)的(de)原(yuan)則，要(yao)求(qiu)慢凍快融(rong)，之所以要(yao)求(qiu)快速，是因為在菌種(zhong)(zhong)(zhong)復(fu)蘇(su)(su)(su)的(de)過程(cheng)中, 長時(shi)間的(de)溶解過程(cheng)會對所保存(cun)(cun)(cun)的(de)菌種(zhong)(zhong)(zhong)造成損傷，而(er)我們(men)經(jing)過改良的(de)保存(cun)(cun)(cun)方(fang)法很程(cheng)度的(de)避免復(fu)蘇(su)(su)(su)所造成的(de)影響，但我們(men)還是建議(yi)遵循菌種(zhong)(zhong)(zhong)的(de)保存(cun)(cun)(cun)復(fu)蘇(su)(su)(su)原(yuan)則，保證(zheng)所復(fu)蘇(su)(su)(su)菌種(zhong)(zhong)(zhong)的(de)復(fu)蘇(su)(su)(su)率。

12、將菌株反復凍存，到底對菌株有什么影響？

答(da)：低(di)(di)溫(wen)會使菌(jun)株細胞(bao)(bao)內(nei)的水分(fen)形成冰(bing)(bing)晶(jing)，從(cong)而引起細胞(bao)(bao)結構尤其是(shi)細胞(bao)(bao)膜的損(sun)傷(shang)。細胞(bao)(bao)體積大者(zhe)一般要比較(jiao)小者(zhe)對低(di)(di)溫(wen)更(geng)為敏感(gan)，而無細胞(bao)(bao)壁者(zhe)則比有(you)細胞(bao)(bao)壁者(zhe)敏感(gan)。如果(guo)放到低(di)(di)溫(wen)（不是(shi)一般冰(bing)(bing)箱）進行冷凍時(shi)，會產生冰(bing)(bing)晶(jing)，冰(bing)(bing)晶(jing)呈針狀，極(ji)易導致細菌(jun)的嚴重損(sun)傷(shang)。用電(dian)鏡觀察，可見細菌(jun)的核膜上有(you)大量針尖樣小孔，當從(cong)低(di)(di)溫(wen)下(xia)移出并開(kai)始升(sheng)溫(wen)時(shi)，冰(bing)(bing)晶(jing)又會變(bian)大，故(gu)反復(fu)凍存，會對菌(jun)株造成極(ji)大損(sun)傷(shang)。

13、為什么有時候菌種的保存效果不佳？

答：1、可能是由于(yu)保(bao)存后未(wei)將保(bao)存液吸盡，反復(fu)凍融形成冰(bing)晶損傷菌株(zhu)細胞，影響了菌株(zhu)活性。

2、確定所保(bao)存的菌種是(shi)否(fou)為對數生長期的菌種，我們(men)建議普通菌種保(bao)存為18小(xiao)時內的新(xin)鮮菌種，而霉菌需(xu)要待孢子出現后保(bao)存其孢子。

14、該產品能否用于菌種的運送，如果可以在什么條件下運送？

答(da)：就目前試驗數據而言，我們建(jian)議可(ke)主要(yao)用于(yu)普通(tong)細菌的(de)短期運送，對于(yu)厭氧(yang)菌在運送時讓其(qi)處(chu)于(yu)厭氧(yang)環(huan)境下，2-8℃運送不超過5 天(tian)。另外需要(yao)說明(ming)的(de)是如弧菌屬(shu)和(he)綠膿桿菌需要(yao)常溫運送，其(qi)對2-8℃溫度極(ji)其(qi)敏感。